شناسایی ارقامی از اسفناج که از نظر میزان اسید اگزالیک مطلوب هستند- قسمت ۷

شناسایی ارقامی از اسفناج که از نظر میزان اسید اگزالیک مطلوب هستند- قسمت ۷

مرحله اتصال آغازگر*
مرحله بسط توسطTaq polymerase*

 

۱
۱
۱

 

 

۹۵
باتوجه به Ta آغازگر متفاوتبود
۷۲

 

 

 

۱

 

 

مرحله بسط نهایی
مرحله نگهداری در ترموسایکلر

 

 

۱۰
۲۰

 

 

۷۲
۴

 

 

 

۱

 

 

مرحله نگهداری

 

 

 

 

۴

 

 

* ۳۵ چرخه
۳-۷ الکتروفورز با ژل‏ پلی‏اکریل‏آمید
در این تحقیق از ژل ۸ درصد پلی‏اکریل‏آمید به علت وضوح و شفافیت باندها، تشخیص و قابلیت تفکیک[۱۴۶] بسیار بالا، راحتی سنجش‏های کمی و نگهداری آسان آن استفاده شد (بسام و همکاران، ۱۹۹۳). اجزاء تشکیل دهنده‏و مقدار هر یک از آن‌ ها برای تهیه‏ی ۴۰ سی سی از محلول این ژل به شرح زیر بود:
۱- استفاده از محلول اکریل‌آمید ۴۰ درصد، که در آن نسبت ۱۹ به ۱ (در حجم ۵۰ میلی‏لیتر) اکریل‌آمید-بیس اکریل‌آمید (N,N´- methylenebisacrylamide) رعایت گردیده است. نقش بیس اکریل‌آمید ایجاد اتصالات عرضی در اکریل‌آمید پلیمریزه شده است. ۸ میلیلیتر از این محلول استفاده شد،
۲- محلول TBE10X[147]مرکب از ۸/۱۰۷ گرم تریس، ۴۴/۷ گرم Na2EDTA، حدود ۵۵ گرم اسید بوریک تا ۳/۸=pH بهعلاوه آب دو بار تقطیر تا رسیدن به حجم یک لیتربود. از این محلول ۳ میلی لیتر (یعنی غلظت X1) به‏کار برده شد،
۳- محلول آمونیم پرسولفات[۱۴۸] ۱۰درصد، که از حل شدن ۱/۰ گرم (NH4)2SO4در یک میلی‌لیتر آب دو بار تقطیر به دست می‏آید. این ماده رادیکال‏های آزاد مورد نیاز برای پلیمریزاسیون را ایجاد می‏کند. بهتر است این ماده هر بار بهصورت تازه تهیه گردد. حجم ۵۰۰ مایکرولیتر از آن بلافاصله قبل از ریختن ژل به محلول آن اضافه می‌گردد،
۴-TEMED (N,N,N´,N´-tetramethylenediamine) که بهعنوان کاتالیزور عمل می کند و در حضور آن ژل سریع‌تر می‌بندد. این ماده باید دور از نور نگهداری شود. هرچه مقدار زیادتری از آن استفاده شود ژل سریعتر بسته ولی شکننده‏تر می‏شود. مقدار ۶۰-۵۰ میکرولیتر از این ماده بلافاصله قبل از ریختن ژل، به آن اضافه شد.
الکتروفورز محصولات با بهره گرفتن از دستگاه الکتروفورز عمودی دو طرفه‏ی شرکت PEQ LAB انجام گرفت. به این ترتیب که ابتدا شیشه‏های دستگاه با بهره گرفتن از الکل خوب شستشو داده و سپس با آب مقطر استریل آبکشی شدند. پس از خشک شدن شیشه‏ها، شیشه‏های کوچک برش‏دار را در قاب مخصوص گذاشته و بر روی آنها جدا کننده‏های پلاستیکی موسوم به جدا کننده[۱۴۹] را نصب کرده سپس شیشه‏های بزرگتر را بر روی آنها قرار داده و با وصل کردن گیره‏های فلزی اتصال دو شیشه را به هم محکم گردید تا هنگام تزریق ژل نشتی صورت نگیرد. بعد از حصول اطمینان، محلول ژل را به آرامی و یکنواخت به طوری که حباب ایجاد نشود بین دو شیشه ریخته و بلافاصله شانه‏ها را که از جنس و به ضخامت فضاسازها هستند از بالا در ژل قرار داده شدند. با تنظیم صحیح این شانه، چاهک‌هایی با عمق و ابعاد مناسب ببندد که‌ فرآورده‌های PCR در آن ها بارمی‌شوند در ژل ایجاد شد. پس از آن‌ ژل به مدت ۲ ساعت در محیط ماند تا بهخوبی ‌ببندد و آماده انجام الکتروفورز شد. پس از برداشتن جدا کننده پایینی، ژل بر روی دستگاه الکتروفورز سوار شد. هم‏زمان با بستن ژل، تانک پایینی دستگاه الکتروفورز با بافر TBE یک واحد تا خط مشخص شده پر و شیشه در محل خود قرار داده شد. پس از مدت کوتاهی که ژل در تماس با بافر بود، با احتیاط شانه را خارج و چاهک‌های تشکیل شده را با همان بافر تانک و به کمک یک سرنگ معمولی شستشو شدند تا آکریل‌آمید پلیمریزه نشده درمحلچاهک‌ها باقی نماند و آماده بارگذاری گردند. سپس میزان ۸ میکرولیتر از فراورده‏های PCR را با ۱ میکرولیتر بافر بارگیری مخلوط کرده و در داخل چاهک‏ها بارگذاری کرده و برای تخمین طول قطعات تکثیر شده در یک چاهک از نشانگر bp100 شرکت فرمنتاز استفاده شد تا تعیین دقیق‌تر اندازه تمامی باندها امکانپذیر گردد. بافر بارگیری به سبب مواد رنگی موجود در ترکیب آن (برموفنل بلو[۱۵۰] و زایلن سیانول[۱۵۱]FF) امکان پیگیری میزان حرکت نمونه‌ها برروی ژل را فراهم کرده و نیز با سنگین نمودن نمونه‌ها آن‌ ها را در ته چاهک‌ها ته‌نشین می کند و از خروج آن‌ ها از چاهک و از مخلوط شدنشان با بافر تانک بالایی جلوگیری می‌کند. همچنین به سبب خاصیت واسرشته‌سازی ماده فرمالدهید موجود در آن، به جداسازی قطعات مشابه یا متفاوت موجود در یک فرآورده از هم، که احیاناً پس از PCR به هم متصل گردیده‌اند، کمک می کند.سپس سیم‌های رابط بین منبع تغذیه الکتریکی ژل وصل شده، دستگاه روشن و بر روی ولتاژ ثابت ۷۵ ولت (شدت جریان حدود ۱۰۰ میلی آمپر و توان حدود ۱۵-۱۰ وات) تنظیم گردید و اجازه داده شد نمونه‌ها به مدت ۵-۳ ساعت بر روی ژل حرکت داده شوند (شکل ۳-۱). پس از پایان الکتروفورز، دستگاه خاموش و اتصالات جدا گردید.سپس به آرامی دو شیشه را از هم جدا کرده و با دقت ژل را در داخل تانک حاوی آب مقطر استریل شستشو شد. پس از شستشوی کامل، رنگ‏آمیزی با نیترات نقره انجام گردید.

شکل ۳-۱بارگیری فرآورده‏های واکنشPCR در دستگاه الکتروفورز عمودی
۳-۸-۱ رنگ‌آمیزی ژل با نیترات نقره[۱۵۲]
برای نمایان سازی باندها از روش سریع رنگ‌آمیزی نقره (سانگوینتی[۱۵۳] و همکاران، ۱۹۹۴) استفاده گردید. رنگ‌آمیزی نقره که در گذشته برای تشخیص مقادیر جزئی پروتئین به‌کار برده می‌شد برای نمایان سازی مقادیر اندک اسیدهای نوکلئیکنیز به‌کار گرفته می‏شود. اساس این روش بر پیوند نقره با DNA و تشکیل رسوبی از نقره فلزی بهوسیله فرمالدهید استوار است (بلات[۱۵۴] و همکاران، ۱۹۹۹). روش‌های متعددی برای رنگ‌آمیزی نقره وجود دارد که معمولاً، بر اساس وضعیت شیمیایی یون‌های نقره‌ای که واکنش رنگ‌آمیزی را شروع می‌نمایند، به دو نوع کلی تقسیم می‌شوند:
الف) روش‌های قلیایی: در این روش‌ها از یک ترکیب دی آمینی نیترات نقره در یک محیط شدیداً قلیایی
استفاده می‌گردد و معمولاً ژل در محلول‌های اسیدی رقیق از فرمالدهید ظاهر می‌گردد.
ب) روش‌های اسیدی: در این روش‌ها ژل را در محلول‌های نیترات نقره اشباع ساخته و برای ظهور آن از محلول‌های قلیایی فرمالدهید استفاد می‌شود.
روش‌های قلیایی حساسیت کمتری دارند و برای ژل‌های ضخیم‌تر مناسب می‌باشند در حالی‌که روش‌های اسیدی سریع‌تر بوده و بر روی ژل‌های نازک بهتر جواب می‌دهند (بسام و همکاران، ۱۹۹۳). با توجه به ضخامت زیاد ژل (یک میلی‌متر)، در این تحقیق از روش قلیایی سریع استفاده شد که محلول‌ها و مراحل آن به شرح زیر می‌باشد:
۱- مرحله تثبیت[۱۵۵]: محلول تثبیت کننده (اسیداستیک ۵% و اتانول ۱۰%) همان محلول متوقف کننده است که برای جلوگیری از انتشار مولکول‏های اسیدهای نوکلئیک به داخل زمینه ژل بکار می‏رود و به حذف و خنثی شدن مواد شیمیایی ناخواسته کمک می‏‏کند. ژل به مدت ۵ دقیقه در ظرف حاوی محلول همراه با عمل تکان دادن قرار داده شد. پس از آن برای حذف اسید و مواد باقی‏مانده دیگر که با رنگ‏آمیزی تداخل می‏کنند، ژل حداقل سه بار و هربار دو دقیقه با آب دوبار تقطیر شستشو داده شد. از این محلول در صورت استفاده صحیح حدود ۱۵-۱۰ بار می‏توان استفاده کرد.
۲- مرحله رنگ‏آمیزی[۱۵۶]: محلول نیترات نقره در حضور فرمالدهید به علت داشتن یون‏های مثبت نقره به اسکلت مولکول‏های DNA که دارای گروه های فسفات با بار منفی است متصل می‏شوند. ترکیبات محلول رنگ‏آمیزی شامل اتانول ۱۰% + اسیداستیک ۵% (یا فرمالدهید ۵/۰ درصد) + ۲/۱ گرم نیترات نقره بود که با آب مقطر به حجم ۶۰۰ میلی‏لیتر رسانده شد. در این مرحله ژل را به مدت ۱۰ تا ۱۵ دقیقه در محلول رنگ قرار داده و به آرامی تکانداده شد. بعد از آن بلافاصله ژل با آب دو بار تقطیر سرد خیلی سریع شستشو داده شد، آب مقطر باید سرد باشد تا در مرحله ظهور باندها رنگ ژل سریع تیره نشود. همچنین آبشویی کوتاه باشد که نیاز مجدد به رنگ‏آمیزی نباشد.
۳- مرحله ظهور[۱۵۷]: ژل در ظرف حاوی محلول سود ۳ درصد و فرمالدهید نیم درصد تا زمان ظهور باندها نگه داشته و به آرامی تکان داده شد. با ظهور اولین باندها جهت جلوگیری از تیرگی ژل و تثبیت باندها می‏توان از محلول مرحله اول مجدد استفاده کرد. لازم به ذکر است که هرچه ژل بیشتر در محلول ظهور و بعد از آن در محیط قرار گیرد تیره‏تر و باندهای حاصله ضخیم‏تر می‏شود که این حالت بسیار نامناسب است.
۴- پس از خارج کردن ژل از محلول ظهور و خشک شدن نسبی، ژل با یک لایه نایلونی نازک[۱۵۸] پوشانیده و هوای زیر نایلون به دقت خارج گردید. در صورت نگهداری این ژل ها در شرایط خنک (۴ درجه سانتیگراد)، می‌توان آنها را بدون کاهش کیفیت به مدت ۱ الی ۲ هفته نگهداری کرد.
۳-۹اندازه‎‏گیری اگزالات از بافت برگ اسفناج
۳-۹-۱ اصول روش
بیشتر متدهای معمولی برای اندازه‏گیری اگزالات شامل جداسازی آن از مواد تداخلگر موجود در نمونه گیاهی از طریق رسوب‏گیری، استخراج با کروماتوگرافی و اندازه‏گیری اگزالیک اسید به روش هایی چون تیتراسیون حجمی کلریمتری، اسپکتروسکوپی جذب اتمی، فلوریمتری و کروماتوگرافی مایع می‏باشد که علاوه بر طولانی بودن مراحل آن هر یک به نوبه خود دارای عیوبی بوده و از طرفی میزان بازیابی متد پایین است. در این تحقیق از روش آنزیمی استفاده شد که در آن اگزالات اسفناج توسط آنزیم اگزالات اکسیداز به دی‏اکسید‏کربن و پراکسید هیدروژن تبدیل می‏گردد. پراکسید هیدروژن ایجاد شده سپس در حضور آنزیم پراکسیداز با اکسیداسیون کروموژن مناسب ترکیبی رنگی ایجاد نموده که به روش اسپکتروفتومتری اندازه‏گیری می‏گردد و شدت رنگ آن متناسب با غلظت اگزالات خواهد بود (لاکر[۱۵۹] و همکاران، ۱۹۸۰ و جوزف و پیتر[۱۶۰]، ۱۹۸۷).
۳-۹-۲عصاره‏گیری
مقدار ۵/۰ گرم از برگ اسفناج را با نیتروژن مایع پودر کرده و در یک فالکون ۱۵ میلی‏لیتری ریخته و ml5 اسیدکلریدریک غلیظ به آن اضافه گردید. سپس مخلوط حاصل به مدت ۵ دقیقه ورتکس نموده تا کاملاً همگن گردیدو پس از آن به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۴۲۰۰ در دقیقه سانتریفیوژ شد‏. پس از سانتریفیوژو جدا شدن دو فاز از هم، مایع رویی به آرامی با بهره گرفتن از سمپلر به یک فالکون ۵۰ میلی‏لیتری جدید منتقل گردید. مجدداً به پلیت باقی‏مانده ml5 اسیدکلریدریک غلیظ اضافه و مراحل عصاره‏گیری ۳ مرتبه تکرار و در هر نوبت مایع رویی روی هم ریخته شدند و pHعصاره با سود ۱ نرمال بین ۵ تا ۷ تنظیم شد‏. در مرحله بعد برای گرفتن رنگیزه‏ها طبق دستور کیت (شرکت درمان‏کاو، اصفهان)ذغال فعال به آن افزوده و به مدت ۵ دقیقه با شیکر مخلوط شد. سپس عصاره با بهره گرفتن از یک کاغذ صافی کوچک صاف و از آن به عنوان نمونه استفاده گردید. حجم نهایی عصاره حدود ۲۰ میلی‏لیتر بود.
۳-۹-۳ تهیه محلول آنزیمی
به هر ویال معرف شماره ۲ (معرف آنزیمی لیوفیلیزه) به میزان ml4 از بافر شماره ۱ (محلول بافر سیترات) اضافه کرده و به مدت ۵ دقیقه در حرارت اتاق قرار داده شد تا آنزیم حل شود (این محلول به مدت ۲ روز در حرارت یخچال پایدار است).
۳-۹-۴ روش آزمایش
دو لوله آزمایش یکی برای تست نمونه‏ها ((T و دیگری به عنوان شاهد خالی (B) گرفته شد. به لوله نمونه۱۰۰ ماکرولیتر عصاره اسفناج، ۱۴۰۰ ماکرولیتر آب مقطر و ۵۰۰ ماکرولیتر محلول آنزیمی آماده اضافه و مخلوط گردید. درون لوله شاهد نیز ۱۵۰۰ ماکرولیتر آب مقطر و ۵۰۰ ماکرولیتر محلول آنزیمی آماده ریخته و مخلوط گردید. سپس لوله‏ها را به مدت ۲ ساعت در حرارت اتاق در جای تاریک قرار داده شدند. بعد جذب محلول لوله T هم‏زمان با لوله B در طول موج nm578 قرائت کرده و غلظت اگزالات بر اساس معادله منحنی استاندارد با لحاظ ضریب رقت بر حسب میلی‏مولار در گرم برگ تازه محاسبه شد.
۲ / غلظت محاسبه شدهاز رگرسیون= میزان اگزالات (میلی‏مولار در گرم برگ تازه)
۳-۹-۵ طرز تهیه منحنی استاندارد
دقیقاً مثل روش آزمایش بالا انجام شد ولی به جای عصاره از ۱۰۰ ماکرولیتر محلول استانداردهای (۲/۰ و ۴/۰ و ۶/۰ میلی‏مولار) استفاده گردید. سپس جذب نمونه‏های استاندارد قرائت و با بهره گرفتن از برنامه Excel نمودار آن و معادله خطی رگرسیونی تهیه گردید.

 

جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت jemo.ir مراجعه نمایید.

 

 

جدول ۳-۵ مواد موجود درکیت اگزالات (شرکت درمان‏کاو، اصفهان)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مدیر سایت