سايت مقالات فارسی – بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۱۷

سايت مقالات فارسی – 
بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۱۷

جهت نتیجه خالص‌سازی (purification) به طریق زیر عمل نمودیم:
l10 از محلول نهایی را با l5، DNA loading Buffer در داخل چاهک ژل آگارز load می‌کنیم و مشاهده تنها یک باند در کنار مارکر صحت کار را تأیید می‌کند.
درب نمونه‌ها را با پارافیلم پوشانده و در فریزر گذارده تا جهت sequencing به کمپانی MWG در آلمان ارسال گردد.
فصل سوم
نتایج:
۳-۱ بررسی ماکروسکوپی قارچ درماتوفیت ترایکوفایتون ویولاسئوم
حدود دو هفته پس از کشت نمونه‌ها در محیط SCC جامد، آنها را بررسی کرده و کلنی رشد کرده بر آن که دارای سطح چین دار، شعاعی شکل، ستاره‌‌ای به رنگ سفید و پشت آن به رنگ زرد مایل به قهوه‌ای بود، مشاهده گردید. (شکلهای ۳ـ۱ـ۱ و ۳ـ۱ـ۲)
۳-۲ بررسی میکروسکوپی (ریزبینی) قارچ درماتوفیت ترایکوفایتون ویولاسئوم
از کلنی های رشد کرده بر محیط SCC جامد به روش اسلاید کالچر لام تهیه کرده و در زیرمیکروسکوپ نوری با درشتنمایی۴۰× بررسی گردید. میسلیوم‌های منظم و منشعب با تیغه میانی و کلامیدوکنیدیای نامنظم و میکروکنیدی‌اهای کوچک ومتعدد و چماقی شکل و ماکروکنیدیا‌های استوانه‌ای و ضخیم مشاهده گردید. این ویژگی‌ها با قارچ ترایکوفایتون مورد نظر منطبق بوده وآن را تأیید می‌کرد.(شکل۳-۲ )
۳-۳ : کشت انبوه در محیط SCC مایع
از آنجایی که در این تحقیق هدف بررسی روی ژن قارچ بود لذا می بایست روی DNA بررسی‌ها را انجام داد و از این رو نیاز به میسلیوم زیاد بوده بدین منظور در محیط مایع از کلنی‌های رشد کرده ترایکوفایتون ویولاسئوم کشت داده تا با پخش هاگ‌ها میسلیوم بیشتری حاصل شود.(شکل۳-۳)
۳-۴ استخراج DNA
DNA قارچ درماتوفیت ترایکوفایتون ویولاسئوم با استفاده از روش فنل- کلروفرم- ایزوآمیل الکل استخراج گردید.
محصول حاصل از استخراج در مجاورت مارکر در ژل آگارز ۱%حاوی اتیدیوم بروماید، الکتروفورز گردید.نتیجه به صورت باندی واضح با اندازه بیش از bp23000 مشاهده شد که نشانگر این است که مراحل استخراج DNA به طور صحیح صورت گرفته است. (شکل ۳-۴)
۳- ۵ محصول PCR
حاصل از تکثیر ژن آنزیم اسکوالن اپوکسیداز در قارچ درماتوفیت ترایکوفایتون ویولاسئوم
پس از استخراج DNA با استفاده از پرایمرهای طراحی شده، ژن آنزیم اسکوالن اپوکسیداز در قارچ ترایکوفایتون ویولاسئوم توسط دستگاه ترموسایکلرتکثیر داده شد.الکتروفورزمحصول PCR با استفاده از پرایمرهای Sense وAntisense طراحی شده برای تکثیر این قطعه از ژن در مجاورت مارکر، باندی با اندازه حدود bp 600 را نشان داد. ( شکل ۳-۵ )
۳-۶ خالص سازی محصول PCR جهت توالی یابی
پس از به دست آمدن باند مورد نظر روی ژل، اقدام به خالص سازی آن کرده تا املاح و مواد ممانعت کننده در مراحل توالی یابی حذف گردد. به این منظور از کیت Qiagen استفاده کرده و بعد از اتمام کار مقدار lµ۱۰ از محلول نهایی را با l5، DNA loading Buffer روی ژل آگارزالکتروفورز کرده و مشاهده تنها یک باند در کنار ۱۰۰bp DNA ladder صحت کار را تأیید می‌نمود. (شکل ۳-۶)
۳-۷ تعیین توالی ژن اسکوالن اپوکسیداز در قارچ درماتوفیت ترایکوفایتون ویولاسئوم
از نتایج حاصل از تعیین توالی محصول PCR قطعه ژن حاصله ، توالی نوکلئوتیدی آن به دست آمد که شامل ۶۶۰ نوکلئوتید می باشد و این قطعه، پروتئینی با ۲۲۰ آمینو اسید را رمز می‌کند.
مقایسه توالی این ژن با سایر ژنهای موجود در بانکهای اطلاعات ژنتیکی، همولوژی معنی دار و زیاد آن را با سایر ژنهای کد کننده پروتئین آنزیم اسکوالن اپوکسیداز در قارچها و یوکاریوتهای دیگر نشان می‌دهد. (شکل۳-۷)
شکل (۳-۱-۱) سطح کلنی قارچ ترایکوفایتون ویولاسئوم در محیط جامد SCC
شکل(۳-۲-۱) منظره ریزبینی قارچ ترایکوفایتون ویولاسئوم با درشت نمایی ۴۰×
شکل (۳-۴)
ستون ۱) ۱۰۰bp DNA ladder
ستون ۴)DNA ژنومی استخراج شده از قارچ ترایکوفایتون ویولاسئوم
شکل (۳-۵)
ستون ۱) ۱۰۰bp DNA ladder از بالا به پایین شامل:
۱۳۰۰-۱۲۰۰-۱۱۰۰-۱۰۰۰-۹۰۰-۸۰۰-۷۰۰-۶۰۰-۵۰۰-۴۰۰-۳۰۰-۲۰۰ , ۱۰۰ bp
ستون ۲) محصول PCR الکتروفورز شده از قطعه ژن اسکوالن اپوکسیداز
Y G Y D V I Y F G N G V K I P F P S D A 20
tat gga tac gat gtg ata tat ttt ggc aat ggt gtg aag ata cct ttc cct agc gac gcc 60
N D K I L E G R C F H H G R F I M R L R 40
aac gat aag atc ctg gaa ggc agg tgc ttc cac cac ggc cgc ttt atc atg cgc ctt cga 120
E A A A A N P N V T I V E T K A V S T I 60

دانلود متن کامل پایان نامه در سایت jemo.ir موجود است

مدیر سایت