سامانه پژوهشی – بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۱۶

سامانه پژوهشی – 
بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۱۶

۱۰

۷۲

۲-۵ خالص‌سازی محصولات PCR:
وسایل مورد نیاز:
اسکالپل استریل، تیوب اپندروف ۵/۱ میلی‌لیتری، دستگاه transilluminator، کیت Qiagen ، بن ماری، میکروفیوژ، دستگاه vortex، بافر TE، آب مقطر استریل، تجهیزات الکتروفورز، DNA Loading buffer، ژل آگارز، اتیدیوم بروماید، بافر TAE، سمپلر و سر سمپلرهای مختلف.
برای آنکه قطعه ژنی PCR شده، تعیین توالی (sequencing) گردد، لازم است که ابتدا این قطعه جدا و خالص سازی شود تا هیچگونه املاح زائد و اضافی و بافر، dNTPmix و آنزیم Taq به همراه آن نباشد زیرا این مواد در انجام sequencing ایجاد اشکال می‌کنند. لذا با خالص‌سازی موجب می‌گردیم که فقط قطعه PCR شده حاوی DNA (ژن مورد نظر) باشد.
برای این کار ابتدا باند حاصل از PCR را از ژل آگارز در زیر UV به کمک اسکالپل استریل بریده و داخل میکروتیوب اپندروف می‌گذاریم. در این امر دقت لازم را کرده تا باندهای غیراختصاصی همراه با باند اصلی ما بریده نشوند.
نکته: اگر از زمان جداسازی قطعه ژل تا مراحل خالص سازی زمان زیادی فاصله می‌افتد حتماً در این زمان ژل را درون فریزر  ۲۰- قرار دهید.
برای خالص سازی DNA از ژل آگارز، از کیت کارخانه Qiagen استفاده کرده که این کیت حـاوی ۳ بافـر
مختلف است.

دانلود متن کامل پایان نامه در سایت jemo.ir موجود است

  1. QXI: حلال آگارز است.
  2. QXII: به DNA متصل می‌شود.
  3. PE: برای شستشو و خالص سازی استفاده می‌گردد.

بن‌ماری را روی حرارت  ۵۰ تنظیم کرده و مراحل خالص‌سازی را به شرح زیر انجام دهید.
افزودن l900 از محلول بافر QXI به میکروتیوب حاوی قطعات ژل بریده و انجام vortex به مدت ۳۰ ثانیه
نکته: اگر در حین این کار رنگ محلول قرمز گشت کافی است یک قطره QXI به آن افزوده تا رنگ آن زرد شود.
افزودن l10 از محلول QXII و انجام vortex به مدت ۱۰ ثانیه
نمونه‌ها را درون بن ماری  ۵۰ به مدت ۱۰ دقیقه قرار داده و به فاصله هر دو دقیقه یک بار تیوبها را خارج کرده و به مدت ۱۰ ثانیه vortex نمایید.
نکته: اگر در مراحل انجام کار رنگ محلول تغییر پیدا کرد و دیگر زرد نبود از سدیم استات ۳ مولار به مقدار l10 اضافه نمایید.
سانتریفوژ با نیروی g×۰۰۰/۱۲ به مدت ۳۰ ثانیه و خالی نمودن محلول رویی
افزودن l500 بافر QXI و انجام vortex به مدت ۳۰ ثانیه
سانتریفوژ با نیروی g×۰۰۰/۱۲ به مدت ۳۰ ثانیه و تخلیه محلول رویی
افزودن l500 محلول PE و انجام vortex به مدت ۳۰ ثانیه
سانتریفوژ با نیروی g×۰۰۰/۱۲ به مدت ۳۰ ثانیه و تخلیه محلول رویی
نکته: مرحله ۷ و ۸ را یکبار دیگر نیز انجام می‌دهیم.
میکروتیوبها را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق قرار داده تا رسوب آن خشک گردد و به رنگ سفید درآید.
افزودن l 20 آب مقطر استریل یا بافر TEو انجام vortex به مدت ۳۰ ثانیه
سانتریفوژ با نیروی g×۰۰۰/۱۲ به مدت ۳۰ ثانیه و جدا کردن فاز مایع و انتقال آن به تیوب جدید.

مدیر سایت