دسترسي به منابع مقالات : بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۱۴

دسترسي به منابع مقالات : 
بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۱۴

C+G number: 12 52.17%
Td:72.17
Tm: [%GC method] 73.54
Tm: [2(A+T)+ 4(C+G)] 70.00
۲-۲-۱ آماده سازی پرایمرها:
پرایمرهای خریداری شده به صورت لیوفیلیزه بوده و قبل از مصرف باید به صورت محلول در آیند، لذا به طریقه زیر عمل می‌کنیم:
ابتدا پرایمرها را به مدت ۵ دقیقه با دور ×g12000 سانتریفوژ کرده و سپس به اندازه پروتوکل آن جهت sense: l222 و جهت l :Antisense556 آب مقطر به آن افزوده و سپس به مدت چند ثانیه آن را vortex کرده و سپس l45 از آب مقطر استریل را در دو میکروتیوب ریخته و l5 از این پرایمرهای تهیه شده را به هر یک از آنها اضافه کرده و در نتیجه بدین طریق پرایمرهایی با رقتpmol/mlit 20 به دست می‌آید.
۲-۳ استخراج DNA:
وسایل و مواد مورد نیاز: توده میسلیوم‌، بوته و هاون چینی، ازت مایع ، پروتئیناز K، EDTA،TrisHcl،SDS، فنل،کلروفرم، ایزوآمیل الکل، اتانول ۱۰۰ درصد، اتانول ۷۰درصد، استات سدیم، بن ماری، میکروفیوژ، سانتریفوژ، تیوبهای ۵/۱ میلی لیتری اپندروف، تیوبهای فالکون ۵۰ میلی لیتری، ژل آگارز، بافر TAE، اتیدیوم بروماید، تجهیزات الکتروفورز، دستگاه Transilluminator، سمپلر و سرسمپلرهای مختلف.
روش کار:
جهت این مرحله، روش رضایی و همکاران( ۵۷)مورد استفاده قرار گرفته است. ازت مایع را درون بوته چینی و روی هاون ریخته تا اینها سرد گردند سپس میسلیوم‌ فریزشده را به آن افزوده که قطعه میسلیوم‌ در این ازت بسیار سفت و سخت می‌گردد که توسط هاون آن را آنقدر کوبیده تا به صورت یک پودر بسیار نرم و یکنواخت درآید.
مراحل استخراج DNA به شرح زیر می‌باشد:
ریختن پودر نرم شده میسلیوم‌ درون لوله فالکون به طوریکه تقریباً از نظر حجمی ۲۰ میلی‌لیتر از حجم آن را در برگیرد.
افزودن محلول استخراج DNA، DNA lysis buffer به پودر میسلیوم‌ و همزدن آرام آن.
این محلول شامل EDTA، TrisHcl، SDS است.
افزودن پروتئیناز K
قرار دادن محلول فوق به مدت یکساعت در بن ماری
سانتریفوژ با دور g3000 به مدت ۵ دقیقه تا رسوبات سلولی از آن جدا گردد.
جدا کردن فاز مایع
انتقال فاز مایع به فالکون جدید
افزودن  ۷ ، RNaseH
قرار دادن در بن ماری ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت نیم ساعت
تقسیم فاز مایع در تیوپهای اپندروف
افزودن هم حجم این مایع،ازمحلول PCI، (فنل، کلروفرم، ایزوآمیل الکل) و همزدن شدید آن
سانتریفوژ با دور g×۰۰۰/۱۰ به مدت ۱۰ دقیقه
انتقال فاز مایع به تیوبهای اپندروف و افزودن هم حجم آن، از محلول کلروفرم- ایزوآمیل الکل و همزدن شدید آن
سانتریفوژ با دور g×۰۰۰/۱۰ به مدت ۱۰ دقیقه و جداکردن فاز مایع
افزودن l3 سدیم استات به محلول فوق به انضمام l500 الکل سرد مطلق بطوریکه کاملاً تیوب پر گردد.
انتقال تیوب فوق به فریزر  به مدت ۲۴ ساعت
سانتریفوژ با دور g×۰۰۰/۱۰ به مدت ۲۵ دقیقه تا اینکه در انتهای لوله، رسوب مشاهده گردد.
خالی کردن الکل رویی
افزودن l200 اتانول ۷۰ درصد
سانتریفوژ با دور g×۰۰۰/۱۰ به مدت ۱۰ دقیقه
خالی کردن الکل رویی و گذاشتن تیوبها در حرارت اتاق به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه تا الکل باقی مانده تبخیر گردد.
افزودن l20 آب مقطر استریل و up and down کردن آن تا حدی که pellet کاملاً حل شود.
محلول DNAای را که به این صورت تهیه کردیم را می‌توان تا زمان کوتاهی درون یخچال نگهداری کرد اما برای نگهداری دراز مدت باید روی آن اتانل سرد ۱۰۰ درصد ریخته و در فریزر نگهداری کرد و در موقع استفاده مجدد باید این اپندروف حاوی DNA و الکل را با دور g×۰۰۰/۱۵ به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ کنیم و مراحل ۲۱ و ۲۲ را تکرار کنیم.

این مطلب را هم بخوانید :
تحلیل نقش مشارکت مردم در توسعه روستاهای بخش خشکبیجار- قسمت ۲۳

منبع فایل کامل این پایان نامه این سایت pipaf.ir است

مدیر سایت