پژوهش – بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۱۳

پژوهش – 
بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۱۳

تربینافین، اسکوالن اپوکسیدازهای قارچها را از طریق غیررقابتی مهار می‌کند، در حالیکه مهارکننده‌های رقابتی در غلظت زیاد در اسکوالن اپوکسیدازهای پستانداران مؤثرند. برخی حدس زده‌اند که بیش از یک نقطه اتصال روی اسکوالن اپوکسیدازها وجود دارد که شاید به خاطر ساختار سوم پروتئینها باشد.(۵۱)
با این بررسی نقش چربی‌ها در ورود و خروج داروها نیز بررسی می‌شود، زیرا در کاندیدا در غیاب ارگوسترول، polyeneها نیز مؤثر بر آن هستند که این غیرمنتظره است زیرا اینها با ارگوسترول واکنش دارند اما شواهد نشان می‌دهد که چربی‌های دیگر غشاء نیز در این حساسیت دخیلند.
ارگوسترول و اسفنگو لیپید دو جزء اصلی غشاء کاندیدا آلبیکنس هستند و توقف سنتز یکی یا هر دو سبب نقص در تشکیل هیف در محیطهای مختلف و حساسیت دارویی می‌گردد.(۵۳)
علیرغم شیوع بالای درماتوفیتوزیس و مشکلات درمان طولانی مدت به این عفونتها، مقاومت ضدقارچی که در درماتوفیتها ظاهر می‌شود نادر است و این در مقایسه با کاندیدیازیس و آسپرژیلوزیس است که موارد مقاوم جدا شده به انواع ضدقارچها در آنها تشخیص و شناسایی شده است.(۴۰)
فصل دوم
مواد و روش ها:
قارچ ترایکوفایتون تونسورنس، فیلدوپلاتین، پنس، شعله، لام، لامل،اسکالپل استریل،لاکتو فنل کاتن بلو، بلودومتیلن، پلیت یکبار مصرف، پلیت شیشه‌ای، پودر سابورودکستروز آگار، پودر سابورو دکستروز برات، پودر کلرامفنیکل، لوله U شکل، ارلن ۱۰۰۰ سی‌سی، پیپت ۱۰۰سی سی ، استن، الکل ۹۵ درجه ، پتاس ۱۰۰ درصد، آب مقطر، میکروسکوپ نوری، انکوباتور
طرز تهیه محیط کشت سابورو دکستروز آگار (SDA): به یک لیتر آب مقطر، ۳۲ گرم پودر آماده سابورو دکستروز آگار اضافه شد. پس از جوشاندن و اتوکلاو نمودن صبر کرده تا اندکی سرد شود و سپس در شرایط استریل داخل پلیت ها ریخته تا کاملاً ببندند.
طرز تهیه محیط کشت سابورو دکستروز آگار به همراه سیکلوهگزامید و کلرامفنیکل (SCC): مطابق روش فوق یک لیتر سابورو دکستروز آگار مذاب تهیه گردید. ۵۰۰ میلی گرم سیکلوهگزامید در ۱۰ میلی لیتر استن و همچنین ۵۰ میلی گرم کلرامفنیکل را در ۱۰ میلی لیتر الکل ۹۵ درجه حل کرده و به آگار مذاب اضافه شد. بعد از جوشاندن، اتوکلاو نموده و مدتی صبر کرده تا کمی خنک شود و سپس در شرایط استریل داخل پلیت ها ریخته شد.
طرز تهیه سابورو دکستروز برات به همراه سیکلوهگزامید و کلرامفنیکل: مطابق روش بالا میباشد با این تفاوت که به جای سابورو دکستروز آگار، ۳۰ گرم سابورو دکستروز برات در یک لیتر آب مقطر حل گردید.
طرز تهیه محیط کشت سابورو دکستروز آگار + کلرامفنیکل: ۶۵ گرم پودر آماده سابورودکستروز آگار را وزن کرده و حجم را به یک لیتر می‌رسانیم و سپس ۵/۰ سی‌سی کلرامفنیکل حل شده در آب مقطر را به محلول فوق افزوده و محیط را به مدت ۱۵ اتو کلاو نموده پس از آنکه استریل گردید صبر می‌کنیم تا اندکی خنک شود و دمای آن حدود ۴۰ درجه سانتیگراد برسد. سپس در شرایط استریل زیر هود و در مجاورت شعله آن را درون پلیت ها تقسیم میکنیم.
طرز تهیه محیط کشت سابورو دکستروز برات + کلرامفنیکل: ۱۱۵ گرم پودر آماده سابورو دکستروز برات را وزن کرده و حجم را به ۵۰۰ سی‌سی رسانده و سپس ۵/۲ سی‌سی کلرامفنیکل حل شده در آب مقطر را به محلول فوق افزوده و محیط را به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو نموده، سپس محیطها را از اتوکلاو خارج کرده و صبر می‌کنیم تا کمی خنک گردد و دمای آن حدود ۴۰ درجه سانتیگراد برسد و بعد از آن در شرایط استریل در زیر هود و در مجاورت شعله درون پلیتها تقسیم کرده و مورد استفاده قرار می‌دهیم.
روش کار:
از بیماران مشکوک مبتلا به عفونت قارچی جلدی مراجعه کننده به آزمایشگاه قارچ شناسی دانشکده بهداشت و انستیتو تحقیقات بهداشتی دانشگاه علوم پزشکی تهران، نمونه برداری صورت گرفت. نمونه برداری به این شکل انجام شد که با استفاده از یک اسکالپل استریل، به ملایمت اطراف ضایعه تراشیده شد، به طوریکه پوسته‌ها بر روی لام قرار گرفتند. مقداری از این پوسته ها را در محیط S و SCC به صورت نقطه ای در داخل ژلوز کاشته که در حرارت ۳۰ درجه سانتی گراد نگهداری شدند. بر روی لام حاوی بقیه پوسته ها، یک قطره پتاس ۱۰ درصد ریخته و بر روی آن لامل گذاشته شد و یک تا دوبار به آهستگی از روی شعله عبور داده شد و پس از شفاف شدن پوسته ها، لام با میکروسکوپ نوری ابتدا با درشت نمائی ۱۰× وسپس با درشت نمایی ۴۰× بررسی گردید. مشاهده میسلیوم و آرتروکیندیا در داخل پوسته ها به عنوان شاخص عفونت درماتوفیتوزیس تلقی شد.
حدود ۲ هفته بعد پلیت های نمونه مثبت از نظر ماکروسکوپی بررسی گردیدند. ترایکوفایتون تونسورنس رشد کرده در این بررسی دارای کلنی هایی با سطح چین دار ، شعاعی شکل، ستاره‌‌ای به رنگ سفید و پشت کلنی نیز زرد مایل به قهوه‌ای بود. البته برخی از کلنی ها در سطحشان دارای پیگمان های صورتی رنگ بوده که نشانه موتاسیون شدید خود قارچها بود.
از پلیت های دارای ویژگیهای فوق، اسلاید کالچر تهیه کرده، به این صورت که درون پلیت شیشه ای، یک لوله U شکل و یک لام تمیزقرار داده و سپس اتوکلاوکرده تا کاملاً استریل شود. در مجاورت شعله و در زیر هود با استفاده از اسکالپل استریل، از محیط SCCng> قطعه ژلوزی به اندازه یک سانتی متر مربع بریده، و در روی لامی که روی لوله U شکل درون پلیت شیشه ای می‌باشد، گذاشته شد. سپس با استفاده ازیک آنس استریل، قطعه ای از کلنی قارچ موردمطالعه رادر چهار طرف ژلوز کاشته و یک لامل استریل بر روی آن قرارداده شد. مقداری آب برای جلوگیری از خشک شدن ژلوز به داخل پلیت شیشه ای اضافه گردید و حدود ۲ هفته در حرارت ۳۰ درجه نگهداری شد.
چگونگی بررسی اسلاید کالچر:
لاملی را که روی سطح ژلوز است با پنس استریل برداشته و بر روی لام تمیزی که روی آن یک قطره لاکتوفنل کاتن بلو ریخته شده قرار داده و یک یا دو بار به آهستگی از روی شعله، لام را عبور داده و پس از چند لحظه به وسیله میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ۴۰× و ۱۰× بررسی کرده که میسلیوم‌های منظم و منشعب دارای تیغه میانی و کلامیدوکنیدیای نامنظم و میکروکنیدیا‌های کوچک و متعدد که زنجیره‌وار به دنبال یکدیگر قرار گرفته و چماقی شکل هستند و ماکروکنیدیاهای استوانه‌ای و ضخیم که تعداد سلولهایشان ۵-۳ عدد بود، روئت گردید؛ و مشخصات مزبور قارچ مورد نظر را تأیید نمود.
همچنین ژلوزی را که روی لام قرار داده شده بود را با آنس به آرامی برداشته و یک قطره لاکتوفنل کاتن بلو بر روی آن لام افزوده و روی آن یک لامل تمیز گذاشته و سپس آن را نیز یک تا دو بار به آرامی از روی شعله عبور داده و پس از مدتی با بزرگنمایی ۱۰× و ۴۰× میکروسکوپ نوری مشاهده کردیم که در این لام نیز روئت کلامیدوکنیدیا و ماکروکنیدیا و میکروکنیدیا با ویژگی‌های بالا، نوع قارچ را را ثابت نمود.
ترایکوفاتیون ویولاسئوم را سپس در چند پلیت SCC بخاطر تشکیل توده میسلیومی به همان طریق نقطه‌ای کشت داده و بعد از آن که توده میسلیومی به اندازه کافی به دست آمد، محیط SCC مایع تهیه کرده و در کنار شعله و زیر هود درون پلیتهای یکبار مصرف ریخته، سپس یک قطعه از میسلیوم‌ را با آنس استریل برداشته و درون این پلیتها افزوده و بعد پلیتها را کمی تکان داده تا اسپورها کاملاً درون محیط کشت مایع پخش گردند.سپس این پلیتها را نیز درون انکوباتور دارای دمای  قرار داده تا زمانیکه توده میسلیومی بطور یکنواخت سطح پلیتها را بپوشاند. توده میسلیومی را جمع نموده، آن را با ۱X PBS شستشو داده و در داخل فریزر در دمای -۲۰ درجه گذاشته تا مراحل استخراج DNA بر روی آن انجام شود.
۲-۲ طراحی پرایمرها:
پرایمرها قطعات کوتاه نوکلئوتیدی هستند که توسط آنها قطعه خاصی از ژن مورد نظر را می‌توان ساخت چرا که دارای توالی مکمل قطعه مورد نظر می‌باشند.
برای طراحی پرایمرها ابتدا توالی نوکلئوتیدی ژن سازنده آنزیم اسکوالن اپوکسیداز را در یوکاریوتهایی مانند
Trichophyton rubrum, Aspergillus fumigatus, Emericella nidulans
با استفاده از اطلاعات بانک جهانی ژن (Gen Bank) استخراج گردید.
سپس توالی‌های نوکلئوتیدی در هر یک از این موارد از کدون آغازین (ATG) تا کدون پایانی (TAA)یا(TAG)یا(TGA) مورد مطالعه قرار گرفت و در ضمن با مقایسه ژنهای ارگانیسم‌های مختلف معلوم گردید که برخی مناطق در این موجودات مختلف عیناً یکسان می‌باشند. در اصطلاح به این مناطق، مناطق بسیار ثابت Highly conserved regions می‌گویند.
بعد از تعیین این مناطق، پرایمرها طراحی گردید. بطوریکه برای هر قطعه ژن دو پرایمر باید وجود داشته باشد که به یکی از آنها Sense و دیگری Antisense گفته می‌شود.
Sense:5′ ATA GAT GCC GTG AGG ACA TAT GGA 3 ‘
Antisense:5′ TGA CGC ATG TTC AGG GAA TCA CC 3′
پرایمرها توسط شرکت Alpha DNA کانادا سنتز و از آنجا خریداری گردید که مشخصات پرایمرها به صورت زیر می‌باشد:
Sense: 24-mer
C+G number: 11 45.83%
Td: 68.3
Tm: [% GC method] 72.17
Tm: [2 (A+T) 4(C+G)] 70.00
Antisens: 23-mer

این مطلب را هم بخوانید :
منابع مقالات علمی : بررسی وجود ژن اسکوالن اپوکسیداز- قسمت ۶

دانلود متن کامل پایان نامه در سایت jemo.ir موجود است

مدیر سایت